Miksi WB: n kokeellinen epäonnistuu jatkuvasti? Katso seuraavat syyt!

Puhutaan tänään ongelmasta, joka on aiheuttanut lukemattomia tutkimuskollegoja päänsärkyä - Western blot (WB) -kokeen. Tämä näennäisesti yksinkertainen, mutta täynnä "ansoja" -kokeita, miksi se saa meidät aina kompastumaan uudestaan ​​ja uudestaan? Tarkastellaan nyt epäonnistumisten syitä yhdessä.

I. Ei bändejä

Mahdollisiin syihin voi kuulua:

1. Vasta -ainekysymykset: Vasta -aine voi olla tehoton, epäspesifinen tai sitoutuminen kohdeproteiiniin.
2. Näyteongelmat: Näyte voi sisältää häiritseviä aineita, olla liian vähän pitoisuuksia tai ovat jo huonontuneet.
3. Elektroforeesikysymykset: sopimattomat elektroforeesiolosuhteet, kuten jännite, aika tai puskurin virheellinen käyttö.
4. Siirtoongelmat: Siirtoprosessin aikana ongelmat, kuten sopimattomat kalvon valinta, siirtoaika tai siirtopuskuri.
5. Estää ongelmat: Estoratkaisu voi olla sopimaton tai estoaika voi olla liian pitkä.
6. Värjäysongelmat: Värjäysreagenssi voi olla vanhentunut, herkkä tai väärinkäyttö.

Laitteiden ongelmat: Laitteet voivat toimia väärin tai niitä ei voida kalibroida.

1. Kokeelliset toimintaongelmat: Kokeellista toimintaa ei välttämättä ole standardisoitu, kuten riittämätön pesu tai epätasainen näytteen kuormitus.
2. Proteiinimodifikaatioongelmat: Kohdeproteiini voi suorittaa translaation jälkeiset modifikaatiot, jotka estävät vasta-aineiden tunnistuksen.
3. Kohdeproteiinin ekspressioongelmat: Kohdeproteiinilla voi olla hyvin matala ekspressio tai ilman ekspressiota soluissa tai kudoksissa.

II. Korkea tausta

Mahdollisiin syihin voi kuulua:

1. Korkea vasta -ainepitoisuus: Liian suuren vasta -aineen käyttö voi lisätä epäspesifistä sitoutumista, mikä johtaa korkeaan taustaan.
2. Vasta-aineiden laatuongelmat: Vasta-aineella voi olla korkea epäspesifinen sitoutuminen tai ristireagoivat muiden proteiinien kanssa.
3. Riittämätön esto: Estoratkaisu ei kata tehokkaasti epäspesifisiä sitoutumiskohtia kalvoon, mikä johtaa korkeaan taustaan.
4. Kalvoongelmat: Kalvolla voi olla huono laatu tai saastuminen, mikä johtaa korkeaan taustaan.
5. Epätäydellinen siirto: Siirtoprosessin aikana proteiineja ei ehkä siirretä kokonaan kalvoon, mikä johtaa korkeaan taustaan.
6. Riittämätön pesu: Pesupelit eivät pysty poistamaan sitoutumatonta vasta -ainetta tai muita epäpuhtauksia, mikä johtaa korkeaan taustaan.
7. Reagenssikysymykset: Värjäysreagenssi voi olla liian herkkä tai epävakaa, mikä johtaa korkeaan taustaan.
8. Kokeelliset laiteongelmat: Laitteilla voi olla vuotoja tai häiriöitä, mikä johtaa korkeaan taustaan.
9. Proteiininäytteen ongelmat: Näyte voi sisältää suuren määrän häiritseviä aineita, kuten proteiinien hajoamistuotteita tai muita epäpuhtauksia.
10. Kokeelliset toimintaongelmat: Kokeellista toimintaa ei saa standardisoida, kuten pitkäaikainen inkubaatioaika tai korkea lämpötila.

III. Epäspesifiset nauhat tai väärät proteiininauhan koot

Mahdollisiin syihin voi kuulua:

1. Liian monta solupähkinää, mikä johtaa erilaisiin proteiinien ekspressiotasoihin, mikä johtaa epäjohdonmukaisiin kaistokokoihin tai useiden kaistojen läsnäoloon.
2. Proteiininäytteen hajoaminen, mikä johtaa alhaisempaan proteiinimolekyylipainoon tai useiden vyöhykkeiden läsnäoloon.
3. In vivo ekspressoiduilla proteiininäytteillä voi olla erilaisia ​​modifikaatioiden muotoja, kuten asetylaatio, metylaatio, alkylointi, fosforylaatio ja glykosylaatio, mikä johtaa epäjohdonmukaisiin kaistakokoihin tai useiden vyöhykkeiden esiintymiseen.
4. Kohdeproteiini sisältää useita isomuotoja tai silmukointivariantteja, mikä johtaa epäjohdonmukaisiin kaistakokoihin tai useiden kaistojen esiintymiseen.